FISH /CISH چیست؟

تکنیک هیبریداسیون در محل توسط Gall and Pardue و همچنین Jone و همکاران در سال ۱۹۶۹ ابداع گردید. این روش مکان‌یابی ژن‌ها یا توالی‌های RNA یا DNA را به طور مستقیم روی کروموزوم‌ها امکان‌پذیر کرده است. در تکنیک FISH اسیدهای نوکلئیک تک رشته‌ای (معمولاً DNA و گاهی اوقات RNA) با یکدیگر تعامل می‌کنند. به طوری که کمپلکس‌ها یا هیبریدهایی را با ایجاد مولکول‌هایی با تشابه زیاد یا توالی‌های مکمل را تشکیل دهند.
پس از هیبریداسیون اسیدهای نوکلئیک، میزان همسانی توالی‌ها تعیین می‌شود. در نتیجه، توالی‌های خاص شناسایی و روی کروموزوم‌های خاص مکان‌یابی می‌شوند.

به طور خلاصه، این تکنیک جزء اولین تکنیک‌های هیستوشیمیایی است که شامل استفاده از دسته‌های مختلفی از رنگ‌های طبیعی و مصنوعی برای رنگ آمیزی ساختارهای سلولی و اجتماعات درون سلولی می‌باشد. این ترکیبات عموماً غیر اختصاصی بوده و برای دسته بندی مولکول‌های خاص مانند پروتین‌ها، اسیدهای نوکلئیک، لیپیدها و کربوهیدرات‌ها به کار می‌روند.
اولین هیبریداسیون در محل در اواخر دهه ۱۹۶۰ انجام گردید که در آن از مواد فلورسنتی خبری نبود و به جای آن از کاوشگرهای نشان دار با رادیو ایزوتوپ‌ها استفاده شد.
روش FISH برای تشخیص اسیدهای نوکلئیک نیز به کار می‌رود و جایگزینی برای روش‌های قدیمی است که از کاوشگرهای رادیو اکتیو استفاده می‌کردند. این روش، مستلزم هیبریداسیون کاوشگر اسید نوکلئیک با اسید نوکلئیک مورد نظر در محل (in situ) است.

مراحل اصلی تکنیک FISH /CISH

در تکنیک FISH، توالی‌های DNA که مکان‌یابی شدند، ابتدا به منظور ایجاد کاوشگرها با مواد فلورسنت نشاندار می‌شوند. سپس کاوشگر با کروموزوم‌های تعیین شده در بافر هیبریداسیون ترکیب می‌شوند. پس از این تیمار و دناتوره شدن DNA به رشته‌های مجزا، کاوشگر و محل تعیین شده برای اتصال مجدد (Re-annealing)، محیا می‌شوند.
کاوشگر به طور اختصاصی با مکان مکمل خود بر روی کروموزوم، باند می‌شود. پس از شستشو و شناسایی با گزارشگر فلورسنت، سیگنال فلورسنت در محل هیبرید کاوشگر به طور جداگانه قابل مشاهده و تشخیص با میکروسکوپ اپی فلورسنت است.
به عبارت دیگر می‌توان گفت که هیبریداسیون در محل یک روش بسیار حساس برای تشخیص فعالیت ژن‌ها به طور مستقیم در سلول یا بافت‌های تثبیت شده‌اند. سلول، بافت یا جنین با فرم‌آمید تثبیت می‌شود. عامل تثبیت کننده از نابودی مولکول‌ها جلوگیری می‌کند و آنها را در محل مورد نظر برای آنالیز نگه می‌دارد.